免疫熒光染色實驗服務

一、制片

選無自發(fā)性熒光的石英玻片或普通優(yōu)質玻片，洗凈后浸泡于無水乙醇和乙氧基乙烷等量混合液中。用時取出用綢布擦凈。將待檢樣品如組織塊剪成適當大小印壓于玻片上。也可采用冰凍切片或石蠟切片樣品。

二、固定

除研究細胞表面抗原或不穩(wěn)定抗原可不固定外，--般均應固定。

固定的作用有三:

1.防止標本從玻片上脫落。

2.除去防礙抗原抗體結合的類脂，使抗原抗體結合物易于獲得良好的染色結果。

3.固定的標本易于保存，如組織切片固定后在-20%C下可保存一年而不改變其染色特性。

標本的固定原則是:

1.不能損傷細胞內(nèi)的抗原。

2.不能凝集蛋白質。

3.不能損傷細胞形態(tài)。

4.固定后應保持細胞膜的通透性，以允許抗體進入與抗原結合。

三、水洗

固定后以冷的0.01 Mol/L pH7 4PBS液浸泡沖洗，后以蒸餾水沖洗，防止自發(fā)性熒光。

四、染色

染色分直接染色法與間接染色法。

1.材料與試劑

(1)熒光抗體，稀釋至應用濃度。

(2) 0.01 Mol/L pH7 .4PBS液

(3) 9份優(yōu)質甘油加1份pH7 .4PBS液即為甘油緩沖液。甘油有減少非特異性熒光的作用。

(4)帶蓋方盤。

2. 直接染色法

(1)將固定好的玻片置于濕盤中，滴加熒光抗體染色液，以覆蓋為度，加蓋，37°C感做30min~45min.

(2) PBS沖洗3次，每次沖洗3 min,即3x3沖洗。

(3)蒸餾水沖洗。

(4)滴甘油緩沖液一滴，封片，熒光顯微鏡檢查。

3.間接染色法

(1) 檢查抗原:

①取固定標本，加已知的免疫血清，37°C孵育30 min。

②以PBS液3x3沖洗。

③再加熒光標記的抗抗體，37°C孵育30 min。

④PBS 3x3沖洗。

⑤H2O沖洗，涼干。

⑥加甘油緩沖液，封片、鏡檢。

(2)檢查抗體:

①兔疫后動物的淋巴組織涂片，自然干燥，甲醇固定。

②滴加相應抗原液(按1: 100~1: 500稀釋)， 37°C孵育30 min.

③PBS液3x3沖洗。

④加熒光抗體，37°C孵育30 min.

⑤PBS液3x3沖洗。

⑥水洗，干。

⑦加甘油緩沖液，封片、鏡檢。

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