斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)服務(wù)實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)

實(shí)驗(yàn)技術(shù)簡介:斑點(diǎn)雜交(Dotblot) 是將被檢標(biāo)本點(diǎn)到膜上，烘烤固定。這種方法耗時(shí)短，可做半定量分析。- 張膜上可同時(shí)檢測多個(gè)樣品，為使點(diǎn)樣準(zhǔn)確方便，市售有多種多管吸印儀(Manifold) , 如MinifoldI和II. Smart Botter(Wealtec).Bio-Dot(Bio-Rad)和Hybri-Dot,它們有許多孔，樣品加到孔中，在負(fù)壓下就會(huì)流到膜上呈斑點(diǎn)狀或狹縫狀。反復(fù)沖洗進(jìn)樣孔，取出膜烤干或紫外線照射以固定標(biāo)本，這時(shí)的膜就可以進(jìn)行雜交。

實(shí)驗(yàn)技術(shù)原理:

斑點(diǎn)雜交是指將待測的DNA變性后點(diǎn)加在硝酸纖維素膜(或尼龍膜、NC膜)上, 用已標(biāo)記的探針進(jìn)行雜交，洗膜(除去未接合的探針)， 放射自顯影，判斷是否有雜交及其雜交強(qiáng)度，主要用于基因缺失或拷貝數(shù)改變的檢測。

實(shí)驗(yàn)操作流程:

1. DNA斑點(diǎn)雜交

①先將膜在水中浸濕，再放到15*SSC中。

②將DNA樣品溶于水或TE，煮沸5min,冰中速冷。

③用鉛筆在濾膜上標(biāo)好位置將DNA點(diǎn)樣于膜上，每個(gè)樣品-般點(diǎn)5ul(2~10μg DNA)。

④將膜烘干，密封保存?zhèn)溆谩?/span>

2、RNA斑點(diǎn)雜交

與上法類似、，每個(gè)樣品至多加10μg總RNA (經(jīng)酚/氨0仿或異硫青酸胍提取純化)。 方法是將RNA溶于5μl DEPC水，加5μI甲醛/SSC緩沖液(10*SSC中含6.15moI/L甲醛) ，使RNA變性，然后取5-8μI點(diǎn)樣于處理好的濾膜上，烘干。

3、完整細(xì)胞斑點(diǎn)雜交

應(yīng)用類似檢測細(xì)菌菌落的方法，可以對細(xì)胞培養(yǎng)物的特異序列進(jìn)行快速檢測，將整個(gè)細(xì)胞點(diǎn)到膜上，經(jīng)NaOH處理，使DNA暴露、變性和固定，再按常規(guī)方法進(jìn)行雜交與檢測。有人曾用此法從105個(gè)培養(yǎng)細(xì)胞中檢測到至少5pg的Epstein-Barr病毒DNA。完整細(xì)胞斑點(diǎn)印跡法可以用于篩選大量標(biāo)本，因?yàn)樗辜?xì)胞直接在膜上溶解，所以DNA含量甚至比常用的提取法還高，又不影響與32P標(biāo)記的探針雜交，但它不適用于非放射性標(biāo)記探針，因?yàn)镈NA純度不夠，會(huì)產(chǎn)生高本底。

實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng):

客戶提供:

TotalRNA (DNA) ≥20ug,濃度> 1ug/ul, A260/A280>1.8;提供標(biāo)記后的探針，需同時(shí)告知標(biāo)記后探針的濃度及活性，待檢測目的基因的Genbank序列號。

交付標(biāo)準(zhǔn):

1、圖片

2.完整項(xiàng)目報(bào)告(材料、試劑、儀器、方法、數(shù)據(jù)分析、實(shí)驗(yàn)結(jié)果)

其他:

1.點(diǎn)樣量不要太大，否則雜交后，X光片上點(diǎn)太大，互相影響。

點(diǎn)樣前尼龍膜無需預(yù)處理，點(diǎn)樣后自然晾干后， 分別在變性液和中和液中進(jìn)行變性和中和。

收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)/服務(wù)周期/提供結(jié)果:

歡迎咨詢詳談，我們會(huì)根據(jù)您的方案及需求制定詳細(xì)的服務(wù)協(xié)議。

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