ELISA中陰性本底的形成原因和消除方法

在酶聯(lián)固相免疫實驗中，尤其在間接ELISA法中，經(jīng)常會碰到陰性本底的問題。主要是本底過高和不同標(biāo)本的本底值差異較大。本底或稱背景，是ELISA中的非特異性顯色。底物未經(jīng)過酶作用而呈現(xiàn)的顏色稱為空白。底物液如配制不當(dāng)會出現(xiàn)一定的空白值。這個空白值只要不太高（A＜0.05），可從各測定值中減除，并不影響實驗結(jié)果。這里討論的是不含待測抗原或抗體的陰性標(biāo)本在ELISA中出現(xiàn)的本底。從理論上來說，只有陰性標(biāo)本zui終才能引起顯色反應(yīng)，那么，為什么會出現(xiàn)本底呢？

  固相載體的吸附：在酶免疫測定中，ELISA的特點是利用分離游離和結(jié)合的酶結(jié)合物的手段。固相載體與吸附在其上的抗原或抗體形成固相抗原或固相抗體，即免疫吸附劑（Immu-nosorbent）。通常所用的固相載體聚苯乙烯其表面主要是疏水基團(tuán)，通過疏水鍵與蛋白質(zhì)結(jié)合。這種物理性吸附是非特異性的，雖然蛋白質(zhì)的分子量、等電點、濃度等對吸附的量有一定的影響，但總的來說各種蛋白質(zhì)均能吸附在聚苯乙烯載體的表面。因此除在包被時有目的地使抗原或抗體吸附在載體上外，在ELISA各個步驟中均有可能發(fā)生干擾物質(zhì)的吸附，使zui終產(chǎn)生與受檢抗原－抗體反應(yīng)無關(guān)的顯色，這是形成本底的主要原因。