基本方法的操作如下: 1.將病原體的抗原在碳酸鹽緩沖液中4~C過夜包被,形成固相抗原,洗滌去除未與固相結(jié)合或結(jié)合不緊的抗原后,用小牛血清或牛血清白蛋白等封閉,洗滌去除未結(jié)合的部分及雜質(zhì)。
2.加入含待測抗體的臨床樣本如血清等,溫育一定時間后洗板;此時,待測抗體就會與固陽上特異抗原反應而吸附于固相上。
3.加入酶標記的抗人IgG抗體,溫育一定時間后洗板;此時,在固相上即形成固相抗原—待測抗體—酶標二抗復合物。
4.加入酶底物,溫育顯色測定(圖2—6)。
間接法測抗體在目前應用zui多的是丙型肝炎病毒抗體(抗HCV)、人免疫缺陷病毒抗體(抗HIV)以及梅毒螺旋體抗體等的測定。從上述的測定模式可見,間接法測抗體,嚴格地講,所測定的僅為抗體的IgG類,不涉及IgM和IgA類,這是由酶標二抗體所決定的。
影響間接法測定抗體的一個較大的因素是包被抗原的純度?,F(xiàn)在間接法測抗體中所使用的抗原一般均為基因工程重組抗原,如HCV的NS3,NS4,NS5,HIV的gp41和gpl20和梅毒螺旋體TpNl5,TpNl7,TpN47等?;蚬こ炭乖诩兓瘯r應盡量去除用來表達的宿主如大腸桿菌的抗原,以免由于機體存在對這種宿主抗原的抗體而引起假陽性反應。此外,由于機體的IgG類抗體濃度較高,其中絕大部分為機體接觸外界環(huán)境刺激所產(chǎn)生的非特異IgG,因此,為避免這些高濃度非特異IgG對固相的吸附所致的假陽性反應,通常需對待測樣本做一定程度的稀釋。