可樂定檢測試劑盒使用說明書
【原理】
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物可樂定與微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗磺胺的抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含可樂定的含量成負相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出殘留物可樂定的含量。
【試劑盒技術(shù)指標(biāo)】
規(guī) 格：96孔/盒
靈 敏 度：0.2ppb
檢測時間： 45min
樣本檢測下限：
尿 樣 ………………………………… 0.2ppb
組 織 ………………………………… 0.4ppb
飼 料 …… …………………………… 8ppb
交叉反應(yīng)率：
可樂定………………… 100%
樣本回收率：
尿 樣 ……………………… 95%±10%
組 織 ……………………… 85%±15%
飼 料 ……………………… 85%±15%
【試劑盒組成】
2、 微量測試孔：1×96孔板（12條×8孔）
3、 （標(biāo)準(zhǔn)溶液X6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.2ppb、0.6ppb、1.8ppb、5.4ppb、16.2ppb
4、 可樂定高濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液（1ml/瓶）100 ppb
5、 酶標(biāo)記物 7ml…………………………紅色帽
6、 抗體工作液 7ml……………………… 綠色帽
7、 底物A液 7ml ……………………棕色帽
8、 底物B液 7ml ……………………黑色帽
9、 終 止 液 7ml ……………………黃色帽
10、 2X濃縮復(fù)溶液50 ml ………………藍色帽
11、 2X濃縮洗滌液40 ml ………………白色帽
【 所用儀器、試劑】
具備的儀器：微孔酶標(biāo)儀、氮氣吹干裝置、打印機、均質(zhì)器 、振蕩器、離心機、恒溫箱、天平（感量0.01g）、刻度移液管
微量移液器：單道20µl-200µl、100µl-1000µl、多道 250µl
試 劑： 濃HCl、甲醇、
【實驗前溶液配制】
配液1、將2X濃縮復(fù)溶液用去離子水按照1：1稀釋（1 份濃縮復(fù)溶液+1份去離子水）用于樣本的復(fù)溶。
配液2、將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照 1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。
配液3、 0.1M HCl 溶液
取0.86ml濃HCl加水定溶至100ml。
配液4、樣品提取液溶液
取1ml 0.1M鹽酸加到99ml甲醇中。
【樣本前處理步驟】
樣本處理前須知
處理任何樣本時，都必須注意：
（a）實驗中必須使用一次性吸頭，在吸取不同的試劑時要更換吸頭。
（c）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進行清潔，以避免污染干擾實驗結(jié)果。
（a）尿樣本的處理方法（樣本稀釋倍數(shù)：1）
取50µl清亮尿樣直接測定（如果尿樣渾濁一定要過濾或離心10min，4000r/min，直至得到清亮尿樣），暫不使用的樣本應(yīng)冷凍保存。
由于尿液陰性樣本可能會產(chǎn)生背景干擾 （在某些情況下干擾數(shù)值在標(biāo)準(zhǔn)2到3之間），所以推薦標(biāo)準(zhǔn)3即0.3ppb作為尿液陽性結(jié)果的CUT OFF判斷值。
（b）組織樣本的處理方法（樣本稀釋倍數(shù)：2）
1． 稱取2 ±0.05g的組織，加入4ml樣品提取液，振蕩2min,室溫4000r/min以上離心10min。
2． 取上清2ml，于50℃氮氣或空氣吹干。
3． 加1 ml正己烷溶解干燥的殘留物，再加1ml稀釋后的復(fù)溶液強烈振蕩混合30s，室溫4000r/min以上離心5min。
4． 取50µl進行分析。
（C）飼料樣品的處理方法（樣本稀釋倍數(shù)：40）
1. 稱1.0±0.05g研碎的飼料樣品，加入4ml樣品提取液，放振蕩器上振蕩2min；室溫 4000r/min以上離心10min；
2. 取出上清液50ul與450ul稀釋好的復(fù)溶液混合30s。
取50ul上清進行分析。
【酶標(biāo)免疫分析程序】
操作步驟：
1、 將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置室溫（20-25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
2、 按板架及需要取出微孔條，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。
3、 編號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
4、 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50µl /孔，然后加酶標(biāo)記物50μl/孔，再加入抗體工作液50µl/孔。輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板，25℃環(huán)境反應(yīng)30min。
5、 取出用洗滌液按每孔250μl洗板4-5次，每次浸泡15-30秒，拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）
6、 顯色：每孔加入底物液A液50µl再加B液50µl，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境避光顯色15min。
7、 測定：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)），測定吸光度值（OD值）。
【結(jié)果判定】
結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光值與可樂定的含量成負相關(guān)。
1、 粗略判定
用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ng /ml)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.221，樣本2的吸光度值為0.795，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb為1.81；0.2ppb為1.50；0.6ppb為1.114；1.8ppb為0.660； 5.4ppb為0.318；16.2ppb為0.145。則樣本1的濃度范圍是5.4ppb-16.2ppb；樣本2的濃度范圍是0.6ppb-1.8ppb。乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中可樂定實際含量。
2、 定量分析
（1）百分吸光率的計算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%，即：
百分吸光度值（%） ＝ | B | ×100% |
B0 |
B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B0—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算
以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以可樂定濃度（ng /ml）的半對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中可樂定實際含量。
若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（歡迎來電索取）
3、標(biāo)準(zhǔn)曲線：
B/B0 (%)
0.2 0.6 1.8 5.4 16.2
(ppb) [µg/kg]
圖1：可樂定檢測試劑盒的回歸曲線
4、再現(xiàn)性：
%CV
0 0.2 0.6 1.8 5.4 16.2
(ppb) [µg/kg]
圖2：可樂定檢測試劑盒的精密度
由多個不同的實驗結(jié)果確定了精密度，圖2顯示出可樂定檢測試劑盒的精密度情況，獲得的標(biāo)準(zhǔn)吸收值的變異系數(shù)（%CV）對相應(yīng)可樂定濃度作曲線，可以看到在全部范圍內(nèi)變異系數(shù)如此之低，可以得到很好的再現(xiàn)性。
【注意事項】
1、 使用前將所有試劑溫度回升至室溫20-25℃。試劑及標(biāo)本沒有回到室溫（20-25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
2、 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進行下一步操作。
3、 混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。
4、 反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。
5、 不要使用過了有效日期的試劑盒，稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值的變化。不要交換使用不同批號的盒中試劑。
6、 不用的微孔板放進自封袋密封；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
7、 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個單位（A450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì)。
8、 該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。
【儲存】
原包裝應(yīng)儲存于2～8℃保鮮冷藏，切勿冷凍。
【有效期】
有效期12個月;生產(chǎn)日期、有效期、生產(chǎn)批號見外包裝。
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