豬圓環(huán)病毒實時熒光PCR檢測試劑盒
本試劑盒采用TaqMan探針法實時熒光PCR技術,是針對豬瘟病毒設計的檢測體系,用于疑似感染動物血清或組織等樣本的檢測。
【產(chǎn)品名稱】
通用名稱:豬瘟病毒熒光PCR檢測試劑盒
英文名稱:Classical Swine Fever Virus Fluorescent PCR test kit
【試劑盒組成】
組成成份(25Tests/kit) | 規(guī)格 |
核酸擴增試劑 | |
RT-PCR反應液 | 526.5µl×1管 |
Taq酶(5U/µl) | 8.5µl×1管 |
PCR enhancer | 5.5µl×1管 |
對照品 | |
陰性對照 | 25µl×1管 |
陽性對照 | 25µl×1管 |
注:不同批號的試劑組份不可混用。
【儲存條件及有效期】
本試劑盒貯存于-20℃的條件下有效期為6個月。
【生產(chǎn)日期及批號】
詳見包裝袋和外包裝盒。
【適用儀器(熒光PCR檢測儀)】
Ø ABI公司Prism7000、7300、7500系列
Ø RotorGene系列
Ø Bio-Rad公司的iCycler系列
【自備試劑】
核酸提取試劑。
【樣本采集、存放及運輸】
1.樣本采集:各類型樣本按照常規(guī)方法采集。
2.存放:分離后的血清或者血漿樣本在2℃—8℃條件下保存應不超過72h,-70℃以下可長期保存,但應避免反復凍融(最多凍融3次)。
3.運輸:采用冰壺或泡沫箱加冰密封進行運輸。
【檢驗方法】
1.樣本處理:
用戶可采用病毒RNA提取試劑盒提取RNA用于檢測或保存于-20℃(-80℃更佳)以待檢測。說明:陽性對照及陰性對照無需提取,直接上樣。
2.擴增試劑準備(PCR前準備區(qū)):
從試劑盒中取出RT-PCR 反應液、Taq酶及PCR Enhancer,室溫融化并振蕩混勻后,2000rpm離心10秒。設所需要的PCR反應管管數(shù)為n(n = 樣本數(shù) + 1管陰性對照 + 1管陽性對照),每個測試反應體系配制如下表:
試劑 | RT-PCR反應液 | Taq酶 | PCR enchancer |
用量 | 19.5 µl | 0.3µl | 0.2 µl |
計算好各試劑的使用量,加入一適當體積離心管中,充分混合均勻,2000rpm離心10秒,向設定的n個PCR反應管中分別加入20 µl,轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。
1.加樣(樣本處理區(qū)):
向所設定的n個PCR 反應管中分別加入待檢樣本RNA、陰性對照和陽性對照各5µl,蓋緊管蓋,轉(zhuǎn)移至檢測區(qū)。將PCR反應管排好放入PCR儀內(nèi),記錄樣本擺放順序。
2.PCR擴增(檢測區(qū))
4.1 循環(huán)條件設置
50℃:10 min;
95℃:3 min;
95℃:10sec, 60℃: 1min 40個循環(huán)。
熒光信號收集設在60℃。反應體系設為25ul。
4.2 儀器檢測通道選擇
待測熒光為FAM熒光素,熒光PCR檢測儀熒光信號收集設定為FAM熒光素。
3.結(jié)果分析條件設定:
5.1 閾值(threshold)設定原則以閾值線剛好超過正常陰性對照曲線(無規(guī)則的噪音線)的最高點為準。
5.2 基線(baseline)應選擇該次實驗指數(shù)擴增前所有樣本熒光信號比較穩(wěn)定的一段區(qū)域(所有樣本熒光信號無較大波動),起始點(循環(huán)數(shù))應避開熒光采集起始階段的信號波動,終止點(循環(huán)數(shù))應比最早出現(xiàn)指數(shù)擴增的樣本Ct值減少1-2個循環(huán)。
注:具體設置方法請參照各儀器使用說明書。
4.質(zhì)控標準:
陰性對照的檢測結(jié)果應為陰性;
陽性對照的Ct值應小于等于32.0。
否則,此次實驗視為無效。
1.結(jié)果判斷:
Ø Ct值無讀數(shù)的樣本為陰性。
Ø Ct值≤38.0的樣本為陽性。
Ø Ct值大于38.0的樣本建議重做。
重做結(jié)果Ct值<40.0為陽性,否則為陰性。
【試劑盒使用注意事項】
1. 有關實驗室管理規(guī)范請嚴格按照行業(yè)行
2. 本試劑盒僅用于體外檢測。
3. 實驗請嚴格分區(qū)操作:
第一區(qū):PCR前準備區(qū)——準備擴增所需試劑;
第二區(qū):樣本處理區(qū)——待測樣本和對照品處理;
第三區(qū):檢測區(qū)——PCR擴增檢測。
4. 各區(qū)物品均為專用,不得交叉使用,避免污染,實驗后即請清潔工作臺。
5. 試劑盒內(nèi)各試劑使用前,充分融化后請稍事離心。
6. 在-20℃保存的樣本裂解產(chǎn)物,應在加樣前置室溫解凍,作短暫離心后使用。
7. 分裝有反應液的反應管應扣蓋或裝入密實袋內(nèi)再轉(zhuǎn)移至樣本區(qū)。
8. 加樣時應使樣品完全落入反應液中,不應有樣品粘附于管壁上,加樣后應盡快蓋緊管蓋。
9. 擴增完畢立即取出反應管,密封在專用塑料袋內(nèi),丟棄于指定地點。
10. 反應液分裝時應盡量避免產(chǎn)生氣泡,上機前注意檢查各反應管是否蓋緊,以免熒光物質(zhì)泄露污染儀器。
11. 實驗中用過的吸頭請直接打入盛有1%次氯酸鈉的廢物缸內(nèi),并與其他廢棄物品一同滅菌后丟棄。
12. 工作臺及各物品定期用1%次氯酸鈉、75%酒精或紫外燈進行消毒
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