EF20A\J2                      2016-01版

己烯雌酚

快速檢測試劑盒說明書

一、原理

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物己烯雌酚將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗己烯雌酚抗體，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物己烯雌酚的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物己烯雌酚的含量。

二、試劑盒特性

u 試劑盒靈敏度：   0.1ppb

u 孵育溫度：       37℃

u 孵育時(shí)間：       30min～30min～15min

u 樣本檢測下限

組織（蝦、魚） ·······························  0.2 ppb

豬肉/肝 雞肉/肝  ·······························  2 ppb

肌肉組織(方法二)  ···························  0.1 ppb

飼 料  ············································  20ppb

尿 液  ···········································  0.6ppb

u 交叉反應(yīng)率

己烯雌酚  ········································  100%

雙烯雌酚  ········································  38.5%

己烷雌酚  ········································  8.5%

己炔雌二醇  ···································  ﹤0.1%

雌三醇  ·········································  ﹤0.1%

u 樣本回收率

飼  料 ··········································  90±10%

組  織 ··········································  85±10%

尿  液 ··········································  70±10%

三、試劑盒組成

四、所用儀器、試劑

具備的儀器：酶標(biāo)儀、均質(zhì)器、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平（感量0.01g）、氮吹儀、恒溫箱

微量移液器：單道 20～200µl、單道100～1000µl、多道 30～300 µl

試      劑：乙腈、氫氧化鈉、氯仿、丙酮、濃磷酸（含量85%）、乙酸乙酯

五、樣本前處理步驟

u 樣本處理前須知

（a）實(shí)驗(yàn)中必須使用一次性吸頭，吸取不同試劑時(shí)要更換吸頭。

（b）實(shí)驗(yàn)之前須檢查各種實(shí)驗(yàn)器具是否干凈，必要時(shí)可對實(shí)驗(yàn)器具進(jìn)行清潔，以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

u 樣本前處理需配制：

配液1   6M H₃PO₄ 溶液

100ml 濃H₃PO₄（含量85%）加去離子水150ml混合均勻。

配液2   2M NaOH溶液

8gNaOH加去離子水100ml溶解。

配液3   1M NaOH溶液

4gNaOH加去離子水100ml溶解。

配液4   乙腈-丙酮混合液

V_乙腈-V_丙酮  =  4 : 1

配液5   樣本復(fù)溶液：

將5X濃縮復(fù)溶液用去離子水1：4稀釋。

u 樣本處理：

（a）組織（雞、鴨、豬肉/豬肝、蝦、魚)處理方法

1、 稱取2±0.05g勻漿后的樣本，加入6ml乙腈-丙酮混合液，震蕩2min，15℃，4000r/min以上，離心10min。

2、 取3ml上清液，60℃氮?dú)?/span>/空氣吹干。

3、 加入0.5ml氯仿，渦動(dòng)20s，加入2ml 2M NaOH，渦動(dòng)30s，4000r/min以上，離心5min。

4、 取1ml上清液，加入200µl 6M H₃PO₄，渦動(dòng)5s。

5、 加入3ml乙腈萃取，振蕩2min，室溫4000r/min以上，離心10min，取上層有機(jī)相， 60℃氮?dú)?/span>/空氣吹干。

6、 用1ml樣本復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，混勻30s。

不同樣本按如下方法稀釋：

1、 蝦魚：直接取50µl水相用于檢測。

2、 豬肉/肝、雞肉/肝：取50µl水相加入450µl樣本復(fù)溶液，渦動(dòng)混合30s；取50µl用于檢測。

樣本的稀釋倍數(shù)：

蝦魚稀釋倍數(shù)：2       

豬肉/肝、雞肉/肝稀釋倍數(shù)：20

（b）肌肉組織處理方法二

1、 稱取2±0.05g勻漿后的樣本，加入2ml  2M NaOH溶液，震蕩2min；

2、 加入8ml乙酸乙酯，劇烈震蕩5min ； 

3、 15℃，4000r/min以上，離心10min；

4、 取4ml上層有機(jī)相， 60℃氮?dú)?/span>/空氣吹干；

5、 用1ml樣本復(fù)溶液溶解干燥的殘留物，混勻30s。

樣本稀釋倍數(shù)：1

（c）飼料處理方法

1、 稱取2±0.05g搗粹后的飼料樣本，加入8ml乙腈，振搖2min，15℃ 4000r/min以上離心10min；

2、 取2ml上清液，60℃氮?dú)?/span>/空氣吹干；

3、 加入0.5ml氯仿，渦動(dòng)20s，加入2ml 1M NaOH，渦動(dòng)30s，4000r/min以上，離心5min；

4、 取1ml上清液，加入100µl 6M H₃PO₄，渦動(dòng)5s；

不同樣本按如下方法稀釋：

1、 配合料：取50µl，加入950µl樣本復(fù)溶液，渦動(dòng)混勻30s，取50µl 用于檢測。

2、 濃縮料/預(yù)混料：取25µl，加入975µl樣本復(fù)溶液，渦動(dòng)混勻30s，取50µl 用于檢測。

樣本稀釋倍數(shù)：

配合料稀釋倍數(shù)：100       

濃縮料、預(yù)混料稀釋倍數(shù)：200  

（d） 尿樣樣本處理方法

1、 取2ml尿液到離心管中，室溫4000r/min以上，離心10min，直至清亮；

2、 移取1ml清亮尿液至離心管中，加入1ml　1M NaOH強(qiáng)烈振蕩5min；

3、 加入100µl  6M H₃PO₄，渦動(dòng)30 s；

4、 再加入8ml氯仿進(jìn)行萃取，振蕩5min。15℃，4000r/min以上離心10min；

5、 去掉上層的水相，取下層有機(jī)相4 ml，60℃氮?dú)?/span>/空氣吹干；

6、 用3ml樣本復(fù)溶液干燥的殘留物，混合30s

7、 取50µl用于分析。

樣本稀釋倍數(shù)：6

六、 酶標(biāo)免疫分析程序:

u 測定前應(yīng)須知：

1、 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫（20～25℃）。

2、 使用之后立即將所有試劑放回2～8℃。

3、 在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點(diǎn)。

4、 所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。

u 操作步驟：

1、 從2～8℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，室溫（20～25℃）平衡30min以上，注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、 取出框架及需要數(shù)量的微孔，將不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。

3、 配液：將40ml濃縮洗滌液（20倍濃縮）用去離子水按照1：19稀釋（1份濃縮洗滌液+19份去離子水），或按所需用量配制洗滌液。

4、 編號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

5、 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加加入抗體工作液50µl/孔，用蓋板膜封板，輕輕振蕩混勻。37℃環(huán)境中反應(yīng)30min。

6、 將孔內(nèi)液體甩干，用已稀釋的洗滌液250µl/孔洗板4～5次，每次間隔15～30秒，用吸水紙拍干（拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

7、 每孔加入酶標(biāo)記物100µl，蓋板膜蓋板后置37℃環(huán)境中反應(yīng)30min。將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌液充分洗，4～5遍（同上），用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

8、 顯色：加入底物A液50µl/孔，再加入底物B液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，37℃環(huán)境中避光顯色15min。

9、 測定：加入終止液50µl/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測，5min內(nèi)讀數(shù)），測定每孔OD值。

七、結(jié)果判定

結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣本吸光度值與其所含己烯雌酚量成負(fù)相關(guān)。

1、粗略判定：

用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.3，樣本2的吸光度值為1.0，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：0ppb為2.243； 0.1ppb為1.816；0.3ppb為1.415；0.9ppb為0.74；2.7ppb為0.313；8.1ppb為0.155。則樣本1的濃度范圍是2.7ppb～8.1ppb；樣本2的濃度范圍是0.3ppb～0.9ppb，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中己烯雌酚實(shí)際濃度。

2、定量分析

（1）百分吸光率的計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以100%，即

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B₀—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/ml）的半對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中己烯雌酚實(shí)際濃度。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（歡迎來電索?。?/span>

八、 注意事項(xiàng)

1、 室溫低于25℃或試劑及標(biāo)本未回到室溫（20～25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

2、 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

3、 混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。

4、 反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。

5、 不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值變化；不要交換使用不同批號的盒中試劑。

6、 不用的微孔板放進(jìn)自封袋重新密封；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

7、 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。標(biāo)準(zhǔn)品1的吸光度值小于0.5時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。

8、 該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為37℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

九、儲藏條件和保質(zhì)期

1、 儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，不要冷凍。

2、 保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。

提示：酶標(biāo)板真空包裝袋若有漏氣，酶標(biāo)板仍然正常有效，不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，請放心使用。

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