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己烯雌酚殘留物快速檢測試劑盒說明書
點(diǎn)擊次數(shù):955 更新時(shí)間:2022-02-09

EF20A\J2                      2016-01

己烯雌酚

快速檢測試劑盒說明書

一、原理

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法,在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原,樣本中的殘留物己烯雌酚將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗己烯雌酚抗體,加入酶標(biāo)記物后,用TMB底物顯色,樣本吸光值與其所含殘留物己烯雌酚的含量成負(fù)相關(guān),與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物己烯雌酚的含量。

二、試劑盒特性

試劑盒靈敏度:   0.1ppb

孵育溫度:       37

孵育時(shí)間:       30min30min15min

樣本檢測下限

組織(蝦、魚) ·······························  0.2 ppb

豬肉/ 雞肉/  ·······························  2 ppb

肌肉組織(方法二)  ···························  0.1 ppb

   ············································  20ppb

尿   ···········································  0.6ppb

交叉反應(yīng)率

己烯雌酚  ········································  100%

雙烯雌酚  ········································  38.5%

己烷雌酚  ········································  8.5%

己炔雌二醇  ···································  0.1%

雌三醇  ·········································  0.1%

樣本回收率

   ··········································  90±10%

   ··········································  85±10%

尿   ··········································  70±10%

三、試劑盒組成

1

微量測試孔

每條8孔,一板12

2

標(biāo)準(zhǔn)液×6

1ml/瓶)

0ppb

0.1ppb

0.3ppb

0.9ppb

2.7ppb

8.1ppb

3

酶標(biāo)記物

12ml

紅色帽

4

抗體工作液

7ml

藍(lán)色帽

5

底物A

7ml

白色帽

6

底物B

7ml

黑色帽

7

終止液

7ml

黃色帽

8

20X濃縮洗滌液

40ml

白色帽

9

5X濃縮復(fù)溶液

50ml

透明帽

四、所用儀器、試劑

具備的儀器:酶標(biāo)儀、均質(zhì)器、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平(感量0.01g)、氮吹儀、恒溫箱

微量移液器:單道 20200µl、單道1001000µl、多道 30300 µl

      劑:乙腈、氫氧化鈉、氯仿、丙酮、濃磷酸(含量85%)、乙酸乙酯

五、樣本前處理步驟

樣本處理前須知

a)實(shí)驗(yàn)中必須使用一次性吸頭,吸取不同試劑時(shí)要更換吸頭。

b)實(shí)驗(yàn)之前須檢查各種實(shí)驗(yàn)器具是否干凈,必要時(shí)可對實(shí)驗(yàn)器具進(jìn)行清潔,以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

樣本前處理需配制:

配液1   6M H3PO4 溶液

100ml H3PO4(含量85%)加去離子水150ml混合均勻。

配液2   2M NaOH溶液

8gNaOH加去離子水100ml溶解

配液3   1M NaOH溶液

4gNaOH加去離子水100ml溶解。

配液4   乙腈-丙酮混合液

V乙腈-V丙酮  =  4 : 1

配液5   樣本復(fù)溶液:

5X濃縮復(fù)溶液用去離子水14稀釋。

樣本處理:

a)組織(雞、鴨、豬肉/豬肝、蝦、魚)處理方法

1、 稱取2±0.05g勻漿后的樣本,加入6ml乙腈-丙酮混合液,震蕩2min,15℃,4000r/min以上,離心10min

2、 3ml上清液,60℃氮?dú)?/span>/空氣吹干。

3、 加入0.5ml氯仿,渦動(dòng)20s,加入2ml 2M NaOH,渦動(dòng)30s,4000r/min以上,離心5min

4、 1ml上清液,加入200µl 6M H3PO4,渦動(dòng)5s。

5、 加入3ml乙腈萃取,振蕩2min,室溫4000r/min以上,離心10min,取上層有機(jī)相, 60℃氮?dú)?/span>/空氣吹干。

6、 1ml樣本復(fù)溶液溶解干燥的殘留物,混勻30s。

不同樣本按如下方法稀釋:

1、 蝦魚:直接取50µl水相用于檢測。

2、 豬肉/肝、雞肉/肝:50µl水相加入450µl樣本復(fù)溶液,渦動(dòng)混合30s;取50µl用于檢測。

樣本的稀釋倍數(shù):

蝦魚稀釋倍數(shù):2       

豬肉/肝、雞肉/肝稀釋倍數(shù):20

b)肌肉組織處理方法二

1、 稱取2±0.05g勻漿后的樣本,加入2ml  2M NaOH溶液,震蕩2min;

2、 加入8ml乙酸乙酯,劇烈震蕩5min ; 

3、 15,4000r/min以上,離心10min;

4、 4ml上層有機(jī)相, 60℃氮?dú)?/span>/空氣吹干;

5、 1ml樣本復(fù)溶液溶解干燥的殘留物,混勻30s。

樣本稀釋倍數(shù):1

c)飼料處理方法

1、 稱取2±0.05g搗粹后的飼料樣本,加入8ml乙腈,振搖2min,15 4000r/min以上離心10min;

2、 2ml上清液,60℃氮?dú)?/span>/空氣吹干;

3、 加入0.5ml氯仿,渦動(dòng)20s,加入2ml 1M NaOH,渦動(dòng)30s,4000r/min以上,離心5min;

4、 1ml上清液,加入100µl 6M H3PO4,渦動(dòng)5s;

不同樣本按如下方法稀釋

1、 配合料:取50µl,加入950µl樣本復(fù)溶液,渦動(dòng)混勻30s,取50µl 用于檢測。

2、 濃縮料/預(yù)混料:取25µl,加入975µl樣本復(fù)溶液,渦動(dòng)混勻30s,取50µl 用于檢測。

樣本稀釋倍數(shù):

配合料稀釋倍數(shù):100       

濃縮料、預(yù)混料稀釋倍數(shù):200  

d 尿樣樣本處理方法

1、 2ml尿液到離心管中,室溫4000r/min以上,離心10min,直至清亮;

2、 移取1ml清亮尿液至離心管中,加入1ml 1M NaOH強(qiáng)烈振蕩5min;

3、 加入100µl  6M H3PO4,渦動(dòng)30 s;

4、 再加入8ml氯仿進(jìn)行萃取,振蕩5min。154000r/min以上離心10min;

5、 去掉上層的水相,取下層有機(jī)相4 ml,60氮?dú)?/span>/空氣吹干;

6、 3ml樣本復(fù)溶液干燥的殘留物,混合30s

7、 50µl用于分析。

樣本稀釋倍數(shù):6

六、 酶標(biāo)免疫分析程序:

測定前應(yīng)須知:

1、 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫(2025)。

2、 使用之后立即將所有試劑放回28。

3、 ELISA分析中的再現(xiàn)性,很大程度上取決于洗板的一致性,正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點(diǎn)。

4、 所有恒溫孵育過程,避免光線照射,用蓋板膜蓋住微孔板。

操作步驟:

1、 28冷藏環(huán)境中取出所需試劑,室溫(2025)平衡30min以上,注意每種液體試劑使用前均須搖勻。

2、 取出框架及需要數(shù)量的微孔,將不用的微孔放入自封袋,保存于2-8。

3、 配液:將40ml濃縮洗滌液(20倍濃縮)用去離子水按照119稀釋(1份濃縮洗滌液+19份去離子水),或按所需用量配制洗滌液。

4、 編號:將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號,每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行,并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

5、 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50µl/孔到各自的微孔中,然后加加入抗體工作液50µl/孔,用蓋板膜封板,輕輕振蕩混勻。37環(huán)境中反應(yīng)30min。

6、 將孔內(nèi)液體甩干,用已稀釋的洗滌液250µl/孔洗板45次,每次間隔1530秒,用吸水紙拍干(拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破)。

7、 每孔加入酶標(biāo)記物100µl,蓋板膜蓋板后置37℃環(huán)境中反應(yīng)30min。將孔內(nèi)液體甩干,用洗滌液充分洗,45遍(同上),用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破)。

8、 顯色:加入底物A50µl/孔,再加入底物B50µl/孔,輕輕振蕩混勻,37環(huán)境中避光顯色15min

9、 測定:加入終止液50µl/孔,輕輕振蕩混勻,設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處(建議用雙波長450/630nm檢測,5min內(nèi)讀數(shù)),測定每孔OD值。

七、結(jié)果判定

結(jié)果判定有兩種方法,粗略判定可用第1種方法,定量判定用第2種方法。注意樣本吸光度值與其所含己烯雌酚量成負(fù)相關(guān)。

1、粗略判定:

用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.3,樣本2的吸光度值為1.0,標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是:0ppb2.243; 0.1ppb1.8160.3ppb1.415;0.9ppb0.742.7ppb0.313;8.1ppb0.155。則樣本1的濃度范圍是2.7ppb8.1ppb;樣本2的濃度范圍是0.3ppb0.9ppb,乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中己烯雌酚實(shí)際濃度。

2、定量分析

1)百分吸光率的計(jì)算,標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值,再乘以100%,即

百分吸光%)=

B

×100%

B0

B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

B0—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算

以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo),以己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)品濃ng/ml)的半對數(shù)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度,乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中己烯雌酚實(shí)際濃度。

若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算,更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。(歡迎來電索?。?/span>

八、 注意事項(xiàng)

1、 室溫低于25℃或試劑及標(biāo)本未回到室溫(2025℃)會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

2、 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況,則會伴隨著標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性,重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。

3、 混合要均勻,否則會出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。

4、 反應(yīng)終止液為2M硫酸,避免接觸皮膚。

5、 不要使用過了有效日期的試劑盒;稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值變化;不要交換使用不同批號的盒中試劑。

6、 不用的微孔板放進(jìn)自封袋重新密封;標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感,因此要避免直接暴露在光線下。

7、 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì),應(yīng)當(dāng)棄之。標(biāo)準(zhǔn)品1的吸光度值小于0.5時(shí),表示試劑可能變質(zhì)。

8、 該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為37℃,溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。

九、儲藏條件和保質(zhì)期

1、 儲藏條件:試劑盒于2-8保存,不要冷凍。

2、  質(zhì) 期:該產(chǎn)品有效期為1年,生產(chǎn)日期見包裝盒。

提示:酶標(biāo)板真空包裝袋若有漏氣,酶標(biāo)板仍然正常有效,不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,請放心使用。

 

2011年開始我們致力于在生命科學(xué)領(lǐng)域、生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)外包及論文潤色服務(wù),協(xié)助客戶各類實(shí)驗(yàn)服務(wù)及論文潤色,是客戶您值得信賴的科研合作伙伴!

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