EF20A\J2 2016-01版
己烯雌酚
快速檢測試劑盒說明書
一、原理
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法,在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原,樣本中的殘留物己烯雌酚將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗己烯雌酚抗體,加入酶標(biāo)記物后,用TMB底物顯色,樣本吸光值與其所含殘留物己烯雌酚的含量成負(fù)相關(guān),與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物己烯雌酚的含量。
二、試劑盒特性
u 試劑盒靈敏度: 0.1ppb
u 孵育溫度: 37℃
u 孵育時(shí)間: 30min~30min~15min
u 樣本檢測下限
組織(蝦、魚) ······························· 0.2 ppb
豬肉/肝 雞肉/肝 ······························· 2 ppb
肌肉組織(方法二) ··························· 0.1 ppb
飼 料 ············································ 20ppb
尿 液 ··········································· 0.6ppb
u 交叉反應(yīng)率
己烯雌酚 ········································ 100%
雙烯雌酚 ········································ 38.5%
己烷雌酚 ········································ 8.5%
己炔雌二醇 ··································· ﹤0.1%
雌三醇 ········································· ﹤0.1%
u 樣本回收率
飼 料 ·········································· 90±10%
組 織 ·········································· 85±10%
尿 液 ·········································· 70±10%
三、試劑盒組成
1 | 微量測試孔 | 每條8孔,一板12條 | |
2 | 標(biāo)準(zhǔn)液×6瓶 (1ml/瓶) | 0ppb | 0.1ppb |
0.3ppb | 0.9ppb | ||
2.7ppb | 8.1ppb | ||
3 | 酶標(biāo)記物 | 12ml | 紅色帽 |
4 | 抗體工作液 | 7ml | 藍(lán)色帽 |
5 | 底物A液 | 7ml | 白色帽 |
6 | 底物B液 | 7ml | 黑色帽 |
7 | 終止液 | 7ml | 黃色帽 |
8 | 20X濃縮洗滌液 | 40ml | 白色帽 |
9 | 5X濃縮復(fù)溶液 | 50ml | 透明帽 |
四、所用儀器、試劑
具備的儀器:酶標(biāo)儀、均質(zhì)器、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平(感量0.01g)、氮吹儀、恒溫箱
微量移液器:單道 20~200µl、單道100~1000µl、多道 30~300 µl
試 劑:乙腈、氫氧化鈉、氯仿、丙酮、濃磷酸(含量85%)、乙酸乙酯
五、樣本前處理步驟
u 樣本處理前須知
(a)實(shí)驗(yàn)中必須使用一次性吸頭,吸取不同試劑時(shí)要更換吸頭。
(b)實(shí)驗(yàn)之前須檢查各種實(shí)驗(yàn)器具是否干凈,必要時(shí)可對實(shí)驗(yàn)器具進(jìn)行清潔,以避免污染干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
u 樣本前處理需配制:
配液1 6M H3PO4 溶液
100ml 濃H3PO4(含量85%)加去離子水150ml混合均勻。
配液2 2M NaOH溶液
8gNaOH加去離子水100ml溶解。
配液3 1M NaOH溶液
4gNaOH加去離子水100ml溶解。
配液4 乙腈-丙酮混合液
V乙腈-V丙酮 = 4 : 1
配液5 樣本復(fù)溶液:
將5X濃縮復(fù)溶液用去離子水1:4稀釋。
u 樣本處理:
(a)組織(雞、鴨、豬肉/豬肝、蝦、魚)處理方法
1、 稱取2±0.05g勻漿后的樣本,加入6ml乙腈-丙酮混合液,震蕩2min,15℃,4000r/min以上,離心10min。
2、 取3ml上清液,60℃氮?dú)?/span>/空氣吹干。
3、 加入0.5ml氯仿,渦動(dòng)20s,加入2ml 2M NaOH,渦動(dòng)30s,4000r/min以上,離心5min。
4、 取1ml上清液,加入200µl 6M H3PO4,渦動(dòng)5s。
5、 加入3ml乙腈萃取,振蕩2min,室溫4000r/min以上,離心10min,取上層有機(jī)相, 60℃氮?dú)?/span>/空氣吹干。
6、 用1ml樣本復(fù)溶液溶解干燥的殘留物,混勻30s。
不同樣本按如下方法稀釋:
1、 蝦魚:直接取50µl水相用于檢測。
2、 豬肉/肝、雞肉/肝:取50µl水相加入450µl樣本復(fù)溶液,渦動(dòng)混合30s;取50µl用于檢測。
樣本的稀釋倍數(shù):
蝦魚稀釋倍數(shù):2
豬肉/肝、雞肉/肝稀釋倍數(shù):20
(b)肌肉組織處理方法二
1、 稱取2±0.05g勻漿后的樣本,加入2ml 2M NaOH溶液,震蕩2min;
2、 加入8ml乙酸乙酯,劇烈震蕩5min ;
3、 15℃,4000r/min以上,離心10min;
4、 取4ml上層有機(jī)相, 60℃氮?dú)?/span>/空氣吹干;
5、 用1ml樣本復(fù)溶液溶解干燥的殘留物,混勻30s。
樣本稀釋倍數(shù):1
(c)飼料處理方法
1、 稱取2±0.05g搗粹后的飼料樣本,加入8ml乙腈,振搖2min,15℃ 4000r/min以上離心10min;
2、 取2ml上清液,60℃氮?dú)?/span>/空氣吹干;
3、 加入0.5ml氯仿,渦動(dòng)20s,加入2ml 1M NaOH,渦動(dòng)30s,4000r/min以上,離心5min;
4、 取1ml上清液,加入100µl 6M H3PO4,渦動(dòng)5s;
不同樣本按如下方法稀釋:
1、 配合料:取50µl,加入950µl樣本復(fù)溶液,渦動(dòng)混勻30s,取50µl 用于檢測。
2、 濃縮料/預(yù)混料:取25µl,加入975µl樣本復(fù)溶液,渦動(dòng)混勻30s,取50µl 用于檢測。
樣本稀釋倍數(shù):
配合料稀釋倍數(shù):100
濃縮料、預(yù)混料稀釋倍數(shù):200
(d) 尿樣樣本處理方法
1、 取2ml尿液到離心管中,室溫4000r/min以上,離心10min,直至清亮;
2、 移取1ml清亮尿液至離心管中,加入1ml 1M NaOH強(qiáng)烈振蕩5min;
3、 加入100µl 6M H3PO4,渦動(dòng)30 s;
4、 再加入8ml氯仿進(jìn)行萃取,振蕩5min。15℃,4000r/min以上離心10min;
5、 去掉上層的水相,取下層有機(jī)相4 ml,60℃氮?dú)?/span>/空氣吹干;
6、 用3ml樣本復(fù)溶液干燥的殘留物,混合30s
7、 取50µl用于分析。
樣本稀釋倍數(shù):6
六、 酶標(biāo)免疫分析程序:
u 測定前應(yīng)須知:
1、 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫(20~25℃)。
2、 使用之后立即將所有試劑放回2~8℃。
3、 在ELISA分析中的再現(xiàn)性,很大程度上取決于洗板的一致性,正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點(diǎn)。
4、 所有恒溫孵育過程,避免光線照射,用蓋板膜蓋住微孔板。
u 操作步驟:
1、 從2~8℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑,室溫(20~25℃)平衡30min以上,注意每種液體試劑使用前均須搖勻。
2、 取出框架及需要數(shù)量的微孔,將不用的微孔放入自封袋,保存于2-8℃。
3、 配液:將40ml濃縮洗滌液(20倍濃縮)用去離子水按照1:19稀釋(1份濃縮洗滌液+19份去離子水),或按所需用量配制洗滌液。
4、 編號:將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號,每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行,并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。
5、 加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本50µl/孔到各自的微孔中,然后加加入抗體工作液50µl/孔,用蓋板膜封板,輕輕振蕩混勻。37℃環(huán)境中反應(yīng)30min。
6、 將孔內(nèi)液體甩干,用已稀釋的洗滌液250µl/孔洗板4~5次,每次間隔15~30秒,用吸水紙拍干(拍干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破)。
7、 每孔加入酶標(biāo)記物100µl,蓋板膜蓋板后置37℃環(huán)境中反應(yīng)30min。將孔內(nèi)液體甩干,用洗滌液充分洗,4~5遍(同上),用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破)。
8、 顯色:加入底物A液50µl/孔,再加入底物B液50µl/孔,輕輕振蕩混勻,37℃環(huán)境中避光顯色15min。
9、 測定:加入終止液50µl/孔,輕輕振蕩混勻,設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處(建議用雙波長450/630nm檢測,5min內(nèi)讀數(shù)),測定每孔OD值。
七、結(jié)果判定
結(jié)果判定有兩種方法,粗略判定可用第1種方法,定量判定用第2種方法。注意樣本吸光度值與其所含己烯雌酚量成負(fù)相關(guān)。
1、粗略判定:
用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣本1的吸光度值為0.3,樣本2的吸光度值為1.0,標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是:0ppb為2.243; 0.1ppb為1.816;0.3ppb為1.415;0.9ppb為0.74;2.7ppb為0.313;8.1ppb為0.155。則樣本1的濃度范圍是2.7ppb~8.1ppb;樣本2的濃度范圍是0.3ppb~0.9ppb,乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中己烯雌酚實(shí)際濃度。
2、定量分析
(1)百分吸光率的計(jì)算,標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的吸光度值的平均值(雙孔)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值,再乘以100%,即
百分吸光率(%)= | B | ×100% |
B0 |
B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值
B0—0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算
以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo),以己烯雌酚標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ng/ml)的半對數(shù)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度,乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中己烯雌酚實(shí)際濃度。
若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計(jì)算,更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。(歡迎來電索?。?/span>
八、 注意事項(xiàng)
1、 室溫低于25℃或試劑及標(biāo)本未回到室溫(20~25℃)會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。
2、 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況,則會伴隨著標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性,重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
3、 混合要均勻,否則會出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。
4、 反應(yīng)終止液為2M硫酸,避免接觸皮膚。
5、 不要使用過了有效日期的試劑盒;稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD值變化;不要交換使用不同批號的盒中試劑。
6、 不用的微孔板放進(jìn)自封袋重新密封;標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感,因此要避免直接暴露在光線下。
7、 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì),應(yīng)當(dāng)棄之。標(biāo)準(zhǔn)品1的吸光度值小于0.5時(shí),表示試劑可能變質(zhì)。
8、 該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為37℃,溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。
九、儲藏條件和保質(zhì)期
1、 儲藏條件:試劑盒于2-8℃保存,不要冷凍。
2、 保 質(zhì) 期:該產(chǎn)品有效期為1年,生產(chǎn)日期見包裝盒。
提示:酶標(biāo)板真空包裝袋若有漏氣,酶標(biāo)板仍然正常有效,不影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果,請放心使用。
從2011年開始我們致力于在生命科學(xué)領(lǐng)域、生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)外包及論文潤色服務(wù),協(xié)助客戶各類實(shí)驗(yàn)服務(wù)及論文潤色,是客戶您值得信賴的科研合作伙伴!
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