TB基因分型試劑盒 VNTR-9
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其它相關(guān)產(chǎn)品
k2571
TB 基因分型試劑盒 HV-3
產(chǎn)品簡介
本試劑盒是以分子流行病學(xué)新一代研究進展
1)
為基礎(chǔ),經(jīng)工藝優(yōu)化后形成的人型結(jié)核分枝桿菌基因分型產(chǎn)品。本產(chǎn)品利用
結(jié)核分枝桿菌基因組中可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列(variable-number tandem repeats, VNTR)多態(tài)性進行基因型分型區(qū)分臨
床菌株,是研究結(jié)核分枝桿菌分子流行病學(xué)和監(jiān)測結(jié)核病傳播狀況的有力工具。與現(xiàn)有其它基于VNTR原理的結(jié)核分枝桿菌
VNTR分型系統(tǒng)相比,這一分型系統(tǒng)對中國流行的菌株具有更強的分辨能力1,2,3),因此特別適合于中國用戶的需求。
通過對各PCR反應(yīng)引物序列和預(yù)混反應(yīng)液成份進行精心優(yōu)化,使得本產(chǎn)品具有很強的抗干擾力。與用戶自配試劑相比,
本產(chǎn)品顯著提升了特異條帶信號強度,降低了使用粗制模板(煮沸菌液)時非特異條帶的出現(xiàn)率,使實驗操作更加簡便、快
捷的同時,提高了檢測成功率。本產(chǎn)品的預(yù)混反應(yīng)液化學(xué)穩(wěn)定性良好,能有效抵抗反復(fù)凍融(10次)和較長時間(一周)
的室溫環(huán)境,更好地適應(yīng)了用戶檢測工作中的靈活性需求。
本產(chǎn)品將人型結(jié)核分枝桿菌(MTBC)鑒定、非結(jié)核分枝桿菌(MOTT)及模板質(zhì)量鑒定、結(jié)核分枝桿菌北京家族菌株
鑒定,和后續(xù)的9位點VNTR分型鑒定整合在一個試劑盒中,使用戶僅需一個試劑盒、12個PCR反應(yīng)即可獲得待測菌株基因
型鑒定所需的完整信息。檢測的分辨力指數(shù)(Hunter-Gaston index,HGI)可達0.989 。并且,基因型鑒定結(jié)果可數(shù)字
化記錄,使得不同樣本批次,不同地區(qū),不同時間,不同研究者之間的實驗數(shù)據(jù)可以很方便地進行比對和匯集分析,
提高了數(shù)據(jù)的使用效率。
對鑒定為VNTR-9基因型成簇(所有9個位點具有相同重復(fù)數(shù))的樣本,若要判定菌株間是否存在近期傳播關(guān)系,需使用
配套產(chǎn)品TB基因分型試劑盒HV-3(貨號K2571),做進一步的分型鑒定。VNTR-9與HV-3兩個產(chǎn)品的結(jié)合使用可將檢測
的HGI提升至0.993 。關(guān)于TB基因分型試劑盒HV-3(貨號K2571)產(chǎn)品的更多信息請見其產(chǎn)品說明書。
1)
參考文獻
1) Luo T et al. Development of a hierarchical variable-number tandem repeat typing scheme for Mycobacterium
tuberculosis in China. PLoS One. 2014 Feb 25;9(2)
2) Sun G et al. Discriminatory potential of a novel set of Variable Number of Tandem Repeats for genotyping
Mycobacterium marinum. Vet Microbiol. 2011 Aug 26;152(1-2)
3) Zhang L et al. Highly polymorphic variable-number tandem repeats loci for differentiating Beijing genotype
strains of Mycobacterium tuberculosis in Shanghai, China. FEMS Microbiol Lett. 2008 May;282(1):22-31.
注意事項
1.為避免污染,建議制備樣本和配制 PCR Mix 在不同的地點內(nèi)進行,并使用不同的移液器。
2.在樣本 DNA 的收集,抽提和擴增的所有環(huán)節(jié)都應(yīng)注意作好標記,同時防止不同樣本間發(fā)生交叉污染。
3.常用試劑和耗材在實驗前需高壓滅菌。
4.每管 PCR Mix 中均含有不同的引物,不可混用??筛鶕?jù)實驗需求一次性分裝為不同的量,避免反復(fù)凍融。
5.為避免打開反應(yīng)管時,反應(yīng)液飛濺,開蓋前請短暫離心,收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上,應(yīng)立刻更換手
套并用 75%酒精或稀酸擦拭桌面。
6.吸取時注意不要交叉污染 PCR Mix,建議每次取 Mix 前用 75%酒精擦拭移液器頭 2 次。
7.
實驗前準備:1×TE 緩沖液(PH=8.0)、0.5×TBE 緩沖液、瓊脂糖、溴化乙錠(EB)、普通 PCR 儀、DNA 電泳設(shè)備和
凝膠成像儀、0.2 ml PCR 反應(yīng)管、八聯(lián)排或 96 孔 PCR 管、不同規(guī)格的移液器:0.5-10 μl 和 20-200 μl。
操作步驟
1.
DNA 模板制備:
1.1 從固體培養(yǎng)基上刮取少量(1-2 接種環(huán))樣本,重懸于 100 μl TE 中,80°C 滅活 30 分鐘。
1.2 滅活后的菌株拿出 P3 實驗室進行如下操作:
100°C 煮沸 10 分鐘(煮沸時 EP 管蓋子可能會爆開,要盡量避免,扣緊 EP 管,不要讓水進入管中),立即置于冰上 2
分鐘,12,000 rpm(~13,400×g)離心 10 分鐘后,取上清置于另一無菌 EP 管中,做上標記,-20°C 保存。
2.
檢測程序:
2.1 取出 TB 基因分型試劑盒 VNTR-9,待液體平衡到室溫后,輕微搖晃 3-4 次混勻,12,000 rpm 離心 5 秒,使蓋上的
液體收集到管內(nèi)。
2.2 結(jié)核分枝桿菌基因型分析:
2.2.1 鑒定樣本是否為人型結(jié)核分枝桿菌(重要!此步驟不可省略?。?/span>
A.PCR 擴增:反應(yīng)體系為 20 μl。
在每個 PCR 管中分別加入 19 μl Mtb 鑒定 PCR Mix,1 μl DNA 模板,混勻。
B.反應(yīng)程序:
C.
制膠,電泳
使用 1%的瓊脂糖凝膠對 PCR 擴增產(chǎn)物進行電泳。
配制 1%的瓊脂糖凝膠,12×6 cm 膠盤制膠,每塊膠為 40 ml。
1)稱取 0.4 g 瓊脂糖,加入 40 ml 0.5×TBE,在天平上稱重后放入微波爐,高火加熱 2-3 分鐘,使瓊脂糖*溶化,搖
勻,觀察為均一透明溶液,無顆粒,再在天平稱量,補入適量的雙蒸水,以保持膠凝膠的濃度不受影響。
2)待融化的凝膠冷卻至 55℃左右時加入 2 μl 溴化乙錠(10 ug/ml),輕輕旋轉(zhuǎn)以充分混勻。用 18 齒的梳子制膠,將
溫?zé)岬哪z澆灌入膠盤。
3)待凝膠*凝結(jié)(室溫下放置 30 分鐘),小心拔出梳子,取出托盤,放入電泳槽中。電泳槽中加入 0.5×TBE 緩沖液,
沒過膠面 1-2 mm。
4)PCR 產(chǎn)物上樣:每個孔中加入 3 μl PCR 產(chǎn)物,每塊膠上留一個孔加入 5 μl MarkerⅠ,每塊膠上加一個 H37Rv 作
為質(zhì)量控制。電壓 150V,電泳時間為 45 分鐘。
結(jié)果顯示:
D.結(jié)果分析:
1)如果出現(xiàn)了 850 和 361 bp 兩條帶,則說明模板 DNA 是人型結(jié)核分枝桿菌,可進入第 F 步(見后面)進行結(jié)核分枝桿
菌北京基因型的分析鑒定,并進一步使用本試劑盒對該菌株進行 9 位點 VNTR 基因型分析鑒定。
2)如果只擴增出 850 bp 的條帶,則說明該菌株屬于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群,但不是人型結(jié)核分枝桿菌,不適用本產(chǎn)品進行
基因型分析鑒定。
4)如果沒有特異性條帶擴增,則說明該菌株是非結(jié)核分枝桿菌或模板 DNA 質(zhì)量不好,不適用本產(chǎn)品進行基因型分析鑒定,
可放棄該樣本,或進入第 E 步(見后面),檢測 DNA 模板的質(zhì)量。
E.DNA 模板質(zhì)量鑒定:
若在以上步驟 A-D 中沒有特異性條帶擴增,則說明模板 DNA 質(zhì)量不佳或該菌株并非結(jié)核分枝桿菌,出現(xiàn)此種情況請
進行如下操作。
1)PCR 擴增:反應(yīng)體系為 20 μl。
在每個 PCR 管中分別加入 19 μl 16S rRNA PCR Mix,1 μl DNA 模板,混勻。
2)反應(yīng)程序:
3)電泳
1%瓊脂糖凝膠電泳,150V 電泳 45 分鐘;
4)結(jié)果顯示:
5)結(jié)果分析:
所有細菌中都存在 16S rRNA 序列,如果樣本無擴增產(chǎn)物,說明模板 DNA 的數(shù)量或質(zhì)量不足以進行 VNTR 基因分型
檢測。如果有擴增產(chǎn)物條帶出現(xiàn),則說明此菌株為非結(jié)核分枝桿菌,不應(yīng)使用本試劑盒進行基因分型鑒定。
F.北京基因型菌株鑒定方法:
在確定菌株為結(jié)核分枝桿菌后,進一步區(qū)分是否屬于北京基因型菌株。
1)PCR 擴增:反應(yīng)體系為 20 μl。
在每個 PCR 管中分別加入 19 μl RD105 PCR Mix,1 μl DNA 模板,混勻。
2)反應(yīng)程序:
3)電泳
1%瓊脂糖凝膠電泳,150V 電泳 45 分鐘。
4)結(jié)果顯示:
5)結(jié)果分析:
如果擴增產(chǎn)物為 1495 bp,該菌株為非北京基因型菌株;
如果擴增產(chǎn)物為 786 bp,該菌株為北京基因型菌株。
2.2.2 結(jié)核分枝桿菌 9 位點 VNTR 基因型分型法:對結(jié)核分枝桿菌臨床菌株進行基因型分析,初步鑒定成簇菌株。
A.PCR 擴增:反應(yīng)體系為 20 μl。
取 9 個 PCR 反應(yīng)管,在每個 PCR 管中分別加入 19 μl QUB-11b,QUB-18,QUB-26,MIRU26,MIRU31,MIRU40,
Mtub21,Mtub04,VNTR2372 的 PCR Mix,加入 1 μl DNA 模板,混勻。
B . 反應(yīng)程序:
C. 制膠、電泳:
C-1:注意事項:
重要!每次實驗需要設(shè)置陽性(H37Rv 菌株 DNA)和陰性對照(去離子水)。
關(guān)鍵!本實驗是以瓊脂糖凝膠電泳為基礎(chǔ)來判讀 VNTR 位點基因型,因此,為了使不同實驗室結(jié)果能準確的相互比較,
在電泳這一步必須要按照統(tǒng)一的標準操作,應(yīng)注意以下幾點:
1) 制膠所用梳子為 18 孔。
2) 凝膠左右邊上的兩個孔由于在電泳過程中容易使條帶變形,影響結(jié)果判讀,舍棄不用,或者在其中一個孔點上陰性對
照,剩余 16 孔分為 12 個樣本,3 個 DNA Marker 和 1 個陽性對照。點樣順序分別為“1,2,M,3,4,5,6,M,
7,8,9,10,M,11,12,H37Rv”,數(shù)字代表樣本,M 代表 DNA Marker。
3) PCR 擴增產(chǎn)物進行首ci電泳并使用 Marker I 時,凝膠濃度為 1%,應(yīng)使用兩電極間距離不小于 30 厘米的電泳槽,電
壓為 150V,時間為 100-120 分鐘。
4) 如果擴增產(chǎn)物片段過大(>1000bp),需要再次電泳并使用 Marker II 時,凝膠濃度為 0.8%,應(yīng)使用兩電極間距離不
小于 30 厘米的電泳槽,電壓 150V,時間為 150 分鐘。
C-2:制膠以及電泳過程:
使用 1%的瓊脂糖凝膠對 PCR 擴增產(chǎn)物進行電泳。
配制 1%的瓊脂糖凝膠,12×12 cm 膠盤制膠,每塊膠為 80 ml。
1)稱取 0.8 g 瓊脂糖,加入 80 ml 0.5×TBE,在天平上稱重后放入微波爐,高火加熱 2-3 分鐘,使瓊脂糖*溶化,搖勻,
觀察為均一透明溶液,無顆粒,再在天平稱量,補入適量的雙蒸水,以保持膠的濃度不受影響。
2)待融化的凝膠冷卻至 55℃左右時加入 4 μl 溴化乙錠(10 ug/ml),輕輕旋轉(zhuǎn)以充分混勻。用 18 齒的梳子制膠,將溫
熱的凝膠澆灌入 12×12 cm 膠盤。
3)待凝膠*凝結(jié)(室溫下放置 40 分鐘),小心拔出梳子,取出托盤,放入電泳槽中。電泳槽中加入 0.5×TBE 緩沖液,
沒過膠面 1-2 mm。
4)上樣電泳:每塊膠中加入 12 個樣本(最邊上的孔不加樣),每個孔中加入 3-5 μl PCR 產(chǎn)物,同時每塊膠上加三個 5 μl
DNA MarkerⅠ,加一個 H37Rv 作為質(zhì)量控制(點樣孔分布見下圖)。電壓 150V,電泳時間為 100-120 分鐘。本步驟
是各位點最終讀數(shù)是否準確的關(guān)鍵,需要統(tǒng)一按照此標準操作。
5)部分位點(QUB-18 及 QUB-26)在臨床菌株中存在擴增產(chǎn)物大于 1000 bp 的情況,對這些擴增產(chǎn)物再利用 0.8%瓊脂
糖凝膠進行電泳,同時加入 DNA MarkerⅡ 作為條帶大小對照,電壓 150V,電泳時間 150 分鐘。
MarkerⅠ
MarkerⅡ
D. 結(jié)果分析:
根據(jù)各臨床菌株擴增條帶與 Marker 相對位置,利用凝膠分析軟件讀出每個條帶的大小。利用各 VNTR 位點重復(fù)單元讀
數(shù)表及 VNTR 位點讀數(shù)規(guī)則,計算出各菌株在該位點的重復(fù)單元數(shù),每個 VNTR 位點重復(fù)單元讀書表及 VNTR 位點讀數(shù)規(guī)
則附后。
結(jié)果報告: Excel 文件(以下表格為結(jié)果報告輸出格式舉例)
比較不同菌株 9 個 VNTR 位點的重復(fù)數(shù),進行成簇分析:如果兩個或兩個以上菌株具有相同 9 位點基因型,則初步鑒
定為成簇菌株,如有必要,可使用配套產(chǎn)品,K2571, TB 基因分型試劑盒 HV-3,做更精細的進一步分型鑒定。如果
分離的菌株具有特異的 9 位點基因型,則鑒定為單一菌株。
附錄 1:VNTR 位點讀數(shù)規(guī)則
附錄 2 :VNTR 位點重復(fù)單元讀數(shù)表
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