乳酸（LA）含量檢測試劑盒說明書微量法

注意：正式測定之前選擇 2-3 個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品內(nèi)容：

提取液：液體50mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體20mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×1瓶，-20℃保存。臨用前加入0.6ml試劑一充分溶解?？煞盅b后-20℃保存， 避免反復(fù)凍融；

試劑三：粉劑×1瓶，-20℃避光保存。臨用前加入6mL試劑一充分溶解；可分裝后-20℃保存，避免反復(fù)凍融；

試劑四：粉劑×1瓶，-20℃避光保存。 臨用前每瓶加入6mL 試劑一混勻，可分裝后-20℃保存，避免反復(fù)凍融；

試劑五：液體3mL×1瓶，4℃保存。

標(biāo)準(zhǔn)品：粉劑×1支，4℃保存。臨用前加入1.04mL提取液配成100µmol/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液；

顯色液的配制：臨用前根據(jù)用量按照試劑三（V）：試劑四（V）：試劑五（V）=1：1：0.5的比例充分混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用；

產(chǎn)品說明：

乳酸是生物體代謝過程中重要的中間產(chǎn)物，與糖代謝、脂類代謝、蛋白質(zhì)代謝及細(xì)胞內(nèi)能量代謝密切相關(guān)，乳酸含量是評估糖元代謝的和有氧代謝的重要指標(biāo)。乳酸在乳酸脫氫酶的作用下生成丙酮酸，同時使NAD⁺還原生成NADH和H⁺，H⁺傳遞給PMS生成的PMSH₂還原特異性底物， 在450nm處有特征吸收峰。

自備實驗用品及儀器：

天平、研缽/勻漿器、離心機(jī)、可見分光光度計/酶標(biāo)儀、微量玻璃比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋、乙醇和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理：

• 組織：按照質(zhì)量（g）：提取液一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴勻漿后于4℃，12000g離心10min后取上清待測。

b. 細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（106個）：提取液一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；于4℃， 12000g離心10min后取上清待測。

c. 血清（漿）：取100µL血清（漿）加入0.9mL提取液，4℃ 12000g離心10min后取上清待測。

二、測定操作

1、分光光度計/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，波長調(diào)至450nm，分光光度計用蒸餾水調(diào)零。

2、標(biāo)準(zhǔn)液的稀釋：將100µmol/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液用蒸餾水稀釋為10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0µmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液待測。

3、加樣表：

三、乳酸含量的計算：

1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以各標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為x軸，以其對應(yīng)的吸光值（?A標(biāo)準(zhǔn)）為y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)方程

y=kx+b，將?A測定帶入公式中得到x（µmol/mL）。2、乳酸含量計算

（1） 按照蛋白含量計算

LA含量（µmol/mg prot）=x×V 樣÷V 樣÷Cpr =x÷Cpr

（2） 按照樣本質(zhì)量計算

LA含量（µmol/g 鮮重）=x×V 樣÷(V 樣÷V 樣總×W)=x ÷W。

（3） 按照細(xì)胞數(shù)量計算

LA含量（µmol/106 cell）=x×V 樣÷(V 樣÷V 樣總×細(xì)胞數(shù)量)=x ÷細(xì)胞數(shù)量

（4） 按照液體體積計算

LA含量（µmol/mL）= 10×x。

V樣品：加入的樣品體積，0.01mL。：W：樣本質(zhì)量，g/mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL， 蛋白濃度需自行測定； V提取液：加入的提取液體積，1mL；細(xì)胞數(shù)量，5×106個；V液體：液體樣本體積，0.1mL。

注意事項：

1. 若測定吸光值?A大于最大濃度標(biāo)準(zhǔn)品OD值，請將樣品體積進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂尯?/font>

再進(jìn)行測定，并在計算公式中乘以稀釋倍數(shù)。

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