規(guī)格:100 管/96 樣
H2S含量測定試劑盒說明書
注意:正式測定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
測定意義:
H2S是一種新型氣態(tài)信號分子,存在于腦內(nèi)的神經(jīng)遞質(zhì),生理濃度的 H2S對神經(jīng)系統(tǒng)海馬的長時(shí)程增強(qiáng)功能具有重要的調(diào)節(jié)作用,并對自發(fā)性高血壓、出血性休克及肝硬化等疾病的過程發(fā)揮著重要的病理生理效應(yīng)。
測定原理:
H2S與醋酸鋅、N, N-二甲基對苯二胺和硫酸鐵銨等反應(yīng)生成亞甲基藍(lán),亞甲基藍(lán)在665nm 處有最大吸收峰,通過測定其吸光值可計(jì)算 H2S含量。
自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器:
天平、低溫離心機(jī)、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板、蒸餾水。
試劑組成和配制:
提取液:液體 100mL×1 瓶,4℃保存。
試劑一:液體 15mL×1 瓶,4℃保存。
試劑二:液體 8mL×1 瓶,4℃保存。
試劑三:液體 8mL×1 瓶,4℃避光保存。
試劑四:液體 8mL×1 瓶,4℃保存。
試劑五:液體 1.5mL×1 管,4℃避光保存。
樣品處理:
1. 組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為1:5~10的比例(建議稱取約0.1g組織,加入1mL提取液)進(jìn)行冰浴勻漿,然后10000g,4℃離心10min,取上清,置冰上待測。
2. 細(xì)菌、真菌:按照細(xì)胞數(shù)量(104個(gè)):提取液體積(mL)為500~1000:1的比例(建議500 萬細(xì)胞加入1mL提取液),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率300w,超聲3秒,間隔7秒,總時(shí)間3min);然后10000g,4℃,離心10min,取上清置于冰上待測。
3. 血清(漿):直接測定。
操作表:
1、 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min,調(diào)節(jié)波長至665nm。
2、 操作表
| 空白管 | 測定管 |
樣品(μL) |
| 75 |
H2O(μL) | 75 |
|
試劑一(μL) | 75 | 75 |
充分震蕩混勻 | ||
試劑二(μL) | 75 | 75 |
10000g,4℃,離心 10min,去上清,留沉淀 | ||
H2O(μL) | 150 | 150 |
10000g,4℃,離心 10min,去上清,留沉淀 | ||
試劑一(μL) | 75 | 75 |
試劑三(μL) | 75 | 75 |
充分震蕩混勻 | ||
試劑四(μL) | 75 | 75 |
12000rpm,4℃,離心 10min,取上清 | ||
試劑五(μL) | 15 | 15 |
混勻,25℃靜置20min,于微量石英比色皿/96孔板中,空白管調(diào)零,測定665nm吸光值,記為 A665。
H2S含量計(jì)算公式:
標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為:y=0.0044x,R2=0.9988
(1)組織樣品
a.按照蛋白濃度計(jì)算
H2S(μmol/mg prot)=A665÷0.0044×V 反總÷(V 樣×Cpr)×10-3 =0.727×A665 ÷Cpr
b.按照樣本重量計(jì)算
H2S(μmol/g)=A665÷0.0044×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×W)×10-3 = 0.727×A665 ÷W
(3) 細(xì)胞
H2S(μmol/104 cell)=A665÷0.0044×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×細(xì)胞數(shù)量(萬個(gè)))×10 -3
=0.727×A 665 ÷細(xì)胞數(shù)量(萬個(gè))
(2)液體樣品 H2S(μmol/L)=A665÷0.0044×V 反總÷V 樣= 727×A665
V 反總:反應(yīng)總體積,0.24mL;V 樣:反應(yīng)中樣品體積,0.075mL;V 樣總:加入提取液體積,
1mL;W:樣品質(zhì)量,g;Cpr:蛋白濃度,mg/mL
標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為:y=0.0022x,R2=0.9988
(1)組織樣品
a.按照蛋白濃度計(jì)算
H2S(μmol/mg prot)=A665÷0.0044×V 反總÷(V 樣×Cpr)×10-3 =1.454 ×A665 ÷Cpr
b.按照樣本重量計(jì)算
H2S(μmol/g)=A665÷0.0044×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×W)×10-3 = 1.454×A665 ÷W
(3) 細(xì)胞
H2S(μmol/104cell )=A665÷0.0044×V 反總÷(V 樣÷V 樣總×細(xì)胞數(shù)量(萬個(gè)))×10-3
=1.454×A665 ÷細(xì)胞數(shù)量(萬個(gè))
(2)液體樣品 H2S(μmol/L)=A665÷0.0044×V 反總÷V 樣= 1454×A665
V 反總:反應(yīng)總體積,0.24mL;V 樣:反應(yīng)中樣品體積,0.075mL;V 樣總:加入提取液體積,
1mL;W:樣品質(zhì)量,g;Cpr:蛋白濃度,mg/mL
注意事項(xiàng)
z低檢出限為8μmol/L。
實(shí)驗(yàn)代做服務(wù):
實(shí)驗(yàn)室代做實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目
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| 染色質(zhì)免疫沉淀分析(CLIP)實(shí)驗(yàn)服務(wù)
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