乳酸（LA）含量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書

微量法

注意：正式測(cè)定之前選擇 2-3 個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

規(guī)格：100T/48S

產(chǎn)品內(nèi)容：

提取液：液體50mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體20mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×1瓶，-20℃保存。臨用前加入0.6ml試劑一充分溶解?？煞盅b后-20℃保存， 避免反復(fù)凍融；

試劑三：粉劑×1瓶，-20℃避光保存。臨用前加入6mL試劑一充分溶解；可分裝后-20℃保存，避免反復(fù)凍融；

試劑四：粉劑×1瓶，-20℃避光保存。 臨用前每瓶加入6mL 試劑一混勻，可分裝后-20℃保存，避免反復(fù)凍融；

試劑五：液體3mL×1瓶，4℃保存。

標(biāo)準(zhǔn)品：粉劑×1支，4℃保存。臨用前加入1.04mL提取液配成100µmol/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液；

顯色液的配制：臨用前根據(jù)用量按照試劑三（V）：試劑四（V）：試劑五（V）=1：1：0.5的比例充分混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用；

產(chǎn)品說(shuō)明：

乳酸是生物體代謝過(guò)程中重要的中間產(chǎn)物，與糖代謝、脂類代謝、蛋白質(zhì)代謝及細(xì)胞內(nèi)能量代謝密切相關(guān)，乳酸含量是評(píng)估糖元代謝的和有氧代謝的重要指標(biāo)。乳酸在乳酸脫氫酶的作用下生成丙酮酸，同時(shí)使NAD+還原生成NADH和H+，H+傳遞給PMS生成的PMSH2還原特異性底物， 在450nm處有特征吸收峰。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：

天平、研缽/勻漿器、離心機(jī)、可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量玻璃比色皿/96孔板、恒溫水浴鍋、乙醇和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理：

a.組織：按照質(zhì)量（g）：提取液一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴勻漿后于4℃，12000g離心10min后取上清待測(cè)。

b.細(xì)胞：按照細(xì)胞數(shù)量（106個(gè)）：提取液一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時(shí)間3min）；于4℃， 12000g離心10min后取上清待測(cè)。

c.血清（漿）：取100µL血清（漿）加入0.9mL提取液，4℃ 12000g離心10min后取上清待測(cè)。

二、測(cè)定操作

1、分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min，波長(zhǎng)調(diào)至450nm，分光光度計(jì)用蒸餾水調(diào)零。

2、標(biāo)準(zhǔn)液的稀釋：將100µmol/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液用蒸餾水稀釋為10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0µmol/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液待測(cè)。

3、加樣表：

測(cè)定管 對(duì)照管 標(biāo)準(zhǔn)管 空白管

樣品（µL） 10 10 - -

標(biāo)準(zhǔn)品（µL） - - 10 -

蒸餾水（µL） - 10 - 10

試劑一（µL） 40 40 40 40

試劑二（µL） 10 - 10 10

工作液（µL） 140 140 140 140

于 37℃準(zhǔn)確反應(yīng) 30min。于 450nm 處測(cè)定吸光值，分別記為 A 測(cè)定管，A 對(duì)照管，A 標(biāo)準(zhǔn)管，A 空白管，計(jì)算?A 測(cè)定=A 測(cè)定管-A 對(duì)照管；?A 標(biāo)準(zhǔn)= A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管。

三、乳酸含量的計(jì)算：

1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以各標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為x軸，以其對(duì)應(yīng)的吸光值（?A標(biāo)準(zhǔn)）為y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)方程

y=kx+b，將?A測(cè)定帶入公式中得到x（µmol/mL）。2、乳酸含量計(jì)算

（1）按照蛋白含量計(jì)算

LA含量（µmol/mg prot）=x×V 樣÷V 樣÷Cpr =x÷Cpr

（2）按照樣本質(zhì)量計(jì)算

LA含量（µmol/g 鮮重）=x×V 樣÷(V 樣÷V 樣總×W)=x ÷W。

（3）按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

LA含量（µmol/106 cell）=x×V 樣÷(V 樣÷V 樣總×細(xì)胞數(shù)量)=x ÷細(xì)胞數(shù)量

（4）按照液體體積計(jì)算

LA含量（µmol/mL）= 10×x。

V樣品：加入的樣品體積，0.01mL。：W：樣本質(zhì)量，g/mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL， 蛋白濃度需自行測(cè)定； V提取液：加入的提取液體積，1mL；細(xì)胞數(shù)量，5×106個(gè)；V液體：液體樣本體積，0.1mL。

注意事項(xiàng)：

1. 若測(cè)定吸光值?A大于大濃度標(biāo)準(zhǔn)品OD值，請(qǐng)將樣品體積進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂尯笤龠M(jìn)行測(cè)定，并在計(jì)算公式中乘以稀釋倍數(shù)。

實(shí)驗(yàn)代做服務(wù)：