在ELISA試劑盒中一般有兩次抗原抗體反應(yīng)，即加標(biāo)本和加酶結(jié)合物后?？乖贵w反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時(shí)間，這一保溫過(guò)程稱為溫育，有人稱之為孵育。

　　溫育這一步是ELISA測(cè)定中容易出現(xiàn)問(wèn)題的步驟。目前國(guó)內(nèi)ELISA試劑盒的反應(yīng)溫育時(shí)間為37℃30分鐘-1小時(shí)，進(jìn)口ELISA試劑盒則通常為37℃1-2小時(shí)才能有較*的結(jié)合，低于1小時(shí)，可能會(huì)影響測(cè)定下限。

　　1.溫育的時(shí)間選擇

　　ELISA屬固相測(cè)定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。以抗體包被的夾心法為例，加入板孔中的標(biāo)本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結(jié)合的機(jī)會(huì)，只有*貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個(gè)逐步平衡的過(guò)程，因此需經(jīng)擴(kuò)散才能達(dá)到反應(yīng)的終點(diǎn)。在其后加入的酶標(biāo)記抗體與固相抗原的結(jié)合也同樣如此。這就是為什么ELISA反應(yīng)總是需要一定時(shí)間的溫育。

　　2.溫育的溫度選擇

　　溫育常采用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等。37℃是實(shí)驗(yàn)室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。

　　在建立ELISA方法作反應(yīng)動(dòng)力學(xué)研究時(shí)，兩次抗原抗體反應(yīng)一般在37℃經(jīng)1-2小時(shí)，產(chǎn)物的生成可達(dá)。為加速反應(yīng)，可提高反應(yīng)的溫度，有些試驗(yàn)在43℃進(jìn)行，但不宜采用更高的溫度?？乖贵w反應(yīng)4℃更為*，在放射測(cè)定中多使反應(yīng)在冰箱中過(guò)夜，以形成沉淀。但因所需時(shí)間太長(zhǎng)，在ELISA中一般不予采用。

　　3.溫育的保溫選擇

　　溫育方式常采用溫箱法、微波輻射法和水浴法。其中水浴法能較好解決因受熱不均衡所致的周圍孔與中央孔結(jié)果的吸光度差異（“邊緣效應(yīng)”即外周孔顯色較中心孔深）。可將ELISA板置于水浴箱中，板底應(yīng)貼著水面，使溫度迅速平衡，為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔，此時(shí)可讓反應(yīng)板漂浮在水面上。

　　若用溫箱，ELISA板應(yīng)放在濕盒內(nèi)，濕盒要選用傳熱性良好的材料（如金屬等），在盒底墊濕的紗布，*后將ELISA板放在濕紗布上。濕盒應(yīng)先放在保溫箱中預(yù)溫至規(guī)定的溫度，特別是在氣溫較低的時(shí)候更應(yīng)如此。為避免酶標(biāo)板底部受水汽或磨損導(dǎo)致的讀數(shù)誤差，一般采用鼓風(fēng)恒溫箱保溫，這個(gè)過(guò)程必須在酶標(biāo)板上方貼封紙，以免蒸發(fā)。

　　無(wú)論是水浴還是濕盒溫育，反應(yīng)板均不宜疊放，以保證各板的溫度都能迅速平衡。室溫溫育的反應(yīng)，操作時(shí)的室溫應(yīng)嚴(yán)格限制在規(guī)定的范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)室溫溫度是指20-25℃，但具體操作時(shí)可根據(jù)說(shuō)明書(shū)的要求控制溫育。

　　室溫溫育時(shí)，ELISA板只要平置于操作臺(tái)上即可。應(yīng)注意溫育的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。為保證時(shí)間，一個(gè)人一次不宜多于兩塊板同時(shí)操作、測(cè)定。